跳转到主要内容

通过子叶植物的农学分动,开发一种快速评估微米西红柿对番茄黄叶卷曲病毒的抗性/敏感性的方法

摘要

客观的

番茄黄卷叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)是严重危害番茄作物的病原菌之一。因此,需要开发治疗或预防TYLCV感染的方法。为此,需要一种方便、快速地评估番茄TYLCV侵染情况的方法。本研究以微型番茄品种“微汤姆”(Micro-Tom)的子叶为材料,建立了一种快速评价TYLCV侵染的方法。

结果

首先,我们构建了含有1.5拷贝的TylCV基因组并转化的二元质粒农杆菌质粒。通过将转化株的农杆菌注射到Micro-Tom的分支中,我们证实了Micro-Tom对TYLCV的敏感性。为了进一步缩短TYLCV感染的评价过程,我们在播种后10天对Micro-Tom的子叶进行了农接种。我们一致地观察到TYLCV感染真叶后10天的典型症状。农用接种6 d后,TYLCV子代DNA均表现出症状。因此,我们的新方案允许在播种后20天内评估TYLCV感染。因此,农接种Micro-Tom子叶将加快抗tylcv的Micro-Toms的筛选过程,能够更快地筛选到大量植株,有助于抗tylcv番茄的发展。

介绍

番茄黄曲叶病毒(TYLCV,属Begomovirus., 家庭Geminiviridae)造成的番茄黄卷叶病是栽培番茄最具破坏性的病害之一,每年造成的经济损失估计达数十亿美元[1].TYLCV是由白蝇传播的,正在迅速蔓延到世界许多国家[2].控制TYLCV最流行的方法是培育抗TYLCV的番茄。然而,目前所有的商业杂交品种对病毒都是耐受的,而不是免疫的[3.].因此,需要开发或建立更有效的TylCV控制方法。

为此,需要开发一种方便、快速地评估育种或工程品种对TYLCV抗性/敏感性的方法。商业化的番茄栽培品种(如Moneymaker和Momotaro)生产大的番茄果实,已经知道通过农业接种方法易感TYLCV [45].然而,种植这些大型番茄植株(170 - 180厘米或更高)需要很大的空间,由于生活史很长(120-180天或更长),评估TYLCV感染需要很长时间。在Solanum lycopersicum微型矮蕃茄品种Micro-Tom因其植株小(10-20厘米高)、生命周期短(70-90天)和易于利用外源基因转化而成为很有吸引力的番茄示范品种农杆菌6].因此,微汤似乎是一种番茄品种,适合在有限的空间中快速评估新开发的泰国控制方法。Micro-Tom也被用作宿主植物,用于研究真菌,细菌和病毒的发病机制[78].然而,据我们所知,目前只有一项TYLCV感染Micro-Tom的研究[8].在先前的研究中,通过与毒母鲜花接种,Micro-Tom首次证明易于泰国患者。虽然粉虱接种自然发生并且是对Begomovirus感染的流行方案,但农业潜水术具有几个优点,例如更容易,更方便地对接种的维持,相比接种相比。然而,从未报道过农农毒理学引入的微米至Tylcv的易感性。因为微米与其他番茄品种遗传不同[9],有必要通过实验评估对Tylcv的敏感性。

在本研究中,我们首先研究了微米是否易受农业癌的泰国患者。然后,为了缩短TylcV感染的整个筛选过程,我们探讨了在子叶阶段的微汤豆蛋白的农学间序列的可行性,尽管病毒复制和运输取决于接种组织的发育阶段,Tylcv的病毒DNA浓度实际上是在诸如子叶和老年人的非分割组织中难以察觉[1011].我们证明,微汤汤姆通过农业癌易患Tylcv,并且微汤队在播种种子后20天内通过其子叶农学分泌的典型症状发育了TylcV感染的典型症状。

主要内容

材料和方法

植物材料

种子的l . esculentum品种Micro-Tom购自番茄种植者供应公司(Fort Myers, FL, USA)。待子叶充分展开,真叶长3 ~ 5mm时,用农接种。播种后一般10天即可达到生长期。

微汤的分支或幼苗农学分子

根癌土壤杆菌应变C58C1RifR(来自Hiroshi Ezura博士的礼物)含有PBI-Tylcv(1.5)(见附加文件1:施工的补充方法)在含有氨苄青霉素(50μg/ ml)和卡霉素(100μg/ ml)的Luria-Bertani(LB)培养基中在30℃下生长,直到600nm处的光密度为1.5。在短暂离心3ml培养物后,将所得沉淀重悬于1ml接种介质中[10mM Tris-HCl(pH7.0)/ 10mM MgCl2].在两株Micro-Tom植株育苗4周后,将悬液注射到其第七枝中。另一种方法是,用牙签划伤上述微型tom幼苗每个子叶的背面,然后用1ml注射器将悬液注射到每个划痕的中心。每次实验中注射两到四株幼苗,重复六次。注射的植物被盖上一个塑料圆顶以保持湿润,然后转移到生长室(25°C,光照16小时,黑暗8小时)。第二天,塑料圆顶被移开,接种的植物生长直到出现症状。

结果

生成农毒素含有部分串联拷贝的TylCV基因组

在Tylcv菌株中,我们选择了Tylcv-以色列(Tylcv-IL)菌株,该菌株于1930年首次报道以色列[12),因为由TYLCV-IL引起的番茄黄卷叶病已经在全球范围内蔓延。在TYLCV毒株中,TYLCV- il毒株的分离数量是最多的,它们已在世界不同地区的至少17个国家被鉴定,包括西班牙、突尼斯、埃及、日本和美国[12].对于双病毒的农接种,需要一个包含多个双病毒基因组副本以及两个复制起点(或保守的茎环区域)的双载体,因为单链TYLCV基因组DNA是通过两个正链起点之间的复制产生的[13].因此,我们在双载体pBI121的左右边界之间引入了1.5份TYLCV基因组DNA。得到的感染克隆pBI-TYLCV(1.5)包含TYLCV基因组的nt 2028-2774、nt 1-2774和nt 1-500,其中茎环区为nt 14-172(图)。1一个)。应变C58C1RifR用pBI-TYLCV(1.5)进行转化,转化株用于农业接种。

图1
图1

Agroinoculation Micro-Tom。一个pBI-TYLCV结构示意图(1.5)。灰色框显示TYLCV基因组的部分串联拷贝。盒子上面的数字表示它们在TYLCV基因组中的位置(以nt为单位)。两个闭合三角形表示TYLCV的茎环区域。RB是T-DNA的右边界LB是T-DNA的左边界。b将含有TYLCV基因组部分串联拷贝的农菌注入Micro-tom的第10支后,腋芽(白色点框内)出现。在芽中观察到典型的TYLCV症状。白色箭头表示注射的位置。c将感染腋芽的叶片(右)与未感染的健康对照的相应叶片(左)进行比较

微汤姆枝条的农接种

首先,我们检查了Micro-Tom是否对TYLCV敏感。因此,我们在幼苗生长4周后种植Micro-Tom,然后将上述农杆菌注射到第七枝的中心。农接种约40天后,观察到明显的症状,如叶片皱缩和叶脉间的薄片卷曲,如图所示。1B,C。我们也观察到微汤植物对真实叶片的同样症状。因此,虽然微米是与其他西红柿的遗传不同,但它是通过农业潜水素易于培养的第一次进行实验证明的。

微孢子虫子叶的农接种

虽然我们证明了这种敏感性,但使用上述传统的农业接种方法来评估(工程)微型汤姆植物是否对TYLCV具有抗性需要很长时间(例如,> 2个月)。因此,为了缩短TYLCV农感染的整个筛选过程,我们探索了microtom子叶农接种的可行性。播种后10天,我们刮取每个幼苗的两个子叶的背面(图。2a)用牙签,并用1ml注射器将上述农药注入每个划痕的中心。农业分类后,我们每天都仔细监测了农业植物幼苗对泰国症状的发展。农业分类后出现的第三和第四个真实叶子开始表明农农部术后8天的症状,如叶变形。在农学分动后的第10天(平均值±标准误差; 10.0±0.3天),清楚地观察到典型的TylCV感染症状,如图4所示。2b、c、第三、第四真叶向下卷曲变窄,叶面在叶脉间呈波浪状。在顶部(第五)真叶中,一致观察到严重的大小减少。相比之下,农接种时已经出现的第一真叶和第二真叶根本没有表现出任何症状。

图2
图2.

微米幼苗的农业分泌物。一个播种后第10天育苗。将含有TYLCV基因组部分串联副本的农杆菌注射到这些幼苗子叶的背面。接种后10天(农用接种前)从上面(b)和从侧面(c).1、第一片真叶;第二、第二真叶;第三,真叶第三;第四、第四是真叶;第五个,第五个真叶

TylCV后代DNA分析

TYLCV子代基因组分析也证实了TYLCV感染。我们首先分析了农接种后10天感染幼苗的真叶。从tylcv感染的幼苗的每一片真叶中分离出总DNA,如附加文件所述1:补充方法。然后使用每个分离的DNA作为模板和一套tylcv特异性引物进行PCR,如附加文件所述1:补充方法。如图1的车道3和4所示。3.A,在第三和第四个真实叶中检测到TylCV后代DNA,证明了TylCV感染的典型症状。另一方面,在没有症状的第一和第二真叶中没有检测到任何后代病毒DNA,其已经在农鸡中出现,如图1的车道1和2所示。3.一种。这种现象对应于之前的报道:Tylcv在含有分割细胞的组织中优先累积[14]病毒在光刺激途径之后传播[11].第一片和第二片真叶似乎太成熟了,TYLCV无法扩散到这些叶子上。

图3
图3.

接种微型树苗真叶DNA提取分析。用tylcv特异性引物从DNA提取液中扩增出PCR产物,用2%琼脂糖凝胶分析。一个接种后10天微胆苗真叶DNA提取分析。M:车道DNA尺寸标记(跟踪1 KB Plus DNA梯,Invitrogen),泳道c:PCR产物使用PBS-Tylcv作为模板,巷1:第一片真叶的PCR产物,巷2:来自第二真叶的PCR产品,巷3:第三片真叶的PCR产物,泳道4:PCR产物来自第四个真叶。b接种后4 ~ 10天微汤姆幼苗第三真叶提取的DNA分析。M:车道一个DNA大小标记(TrackIt 1kb Plus DNA Ladder),泳道c:PCR产物使用PBS-Tylcv作为模板,车道1- - - - - -7:PCR产物来自第三种真实的4-10天接种后。在接种后第6天检测到TylCV病毒DNA

在我们的实验中,第三次真实叶子在农业潜水过程后10天不断展示症状。因此,我们接下来检查Tylcv后代DNA首先在第三个真实叶子上出现。我们从农业分离后4天从10天通过4天从农鸡吞噬的微汤米幼苗的第三个真实叶子收集叶组织,并通过从每种叶片组织分离的DNA PCR分析Tylcv后代DNA。如图1所示。3.b,农接种后第5天未检测到PCR产物,农接种后第6天首次检测到与TYLCV子代DNA对应的PCR产物。这一结果表明,通过PCR分析叶片组织,我们可以在播种后16天内评估野生型(或工程型)微型toms是否感染TYLCV。

讨论

TYLCV由白蝇传播到番茄植株以持续和循环的方式[15].因此,用带毒白蝇接种是一种流行的接种方法。然而,与白蝇接种相比,农业接种有几个优点。农业接种的感染强于白蝇接种[16].虽然农业区域般的虽然大肠杆菌很容易长期维持在−80°C,维持活的白蝇非常费力,并对环境构成潜在威胁[17].

先前的一项研究表明,农业接种作为一种病毒传递系统在抗TYLCV育种计划中的有效性值得怀疑,因为在田间和白蝇介导的传播试验中,对TYLCV具有抗性的野生型番茄种均被农接种的TYLCV感染[16].但是,我们成功生成了转基因拟南芥蒂利亚纳对农接种甜菜严重卷顶病毒免疫的植株[18].通过使用相同的方法,本实验室正在生产抗TYLCV的转基因微型番茄[19].

据我们所知,目前只有一项关于TYLCV感染Micro-Tom的研究报道[8].本研究用带毒白蝇接种2周龄的微孢子虫植株。典型症状出现在接种后3周。也就是说,在播种后至少需要5周时间,在方案中使用白蝇来评估TYLCV感染。本研究首次证实了Micro-Tom对TYLCV的敏感性。此外,我们还首次对microtom的子叶进行了农接种。以前的研究表明,TYLCV优先在含有分裂细胞的组织中积累[14]:在不分裂的组织中,如子叶和老叶,病毒DNA的浓度实际上是难以察觉的[1011].然而,在本研究中,我们证明了微汤汤氏蛋白的农学分动导致Tylcv的全身感染。因此,通过微汤粒子的子酰基杂交,通过分析从叶组织提取的DNA的DNA的PCR分析,通过分析从叶组织中的DNA的PCR分析播种至20天后筛选播种泰国感染的整个过程。结果,对于我们的协议需要比传统接种协议的空间更少。因此,我们的农业潜水议定书能够筛选比目前可用的微米的可用协议更大数量的番茄植物。我们希望我们的议定书将通过加速筛选过程促进抗临床(或免疫)西红柿的发展。

限制

这项研究是使用TYLCV-IL菌株进行的,该菌株于1930年在以色列首次报道。从那时起,已经报道了十多个TYLCV菌株,如TYLCV - mild和Tomato yellow leaf curl Sardinia virus-Spain。为了进一步证实我们的方法的有效性,我们希望未来使用其他TLYCV菌株进行研究。

数据和材料的可用性

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文及其附加文件中。

缩写

TYLCV:

番茄黄卷叶病毒

TYLCV-IL:

Tylcv-以色列

参考文献

  1. 1.

    Skaljac M,加尼米米番茄黄叶卷曲疾病和植物病毒矢量相互作用。以色列J植物SCI。2010; 58:103-11。

    CAS文章谷歌学术

  2. 2.

    Lefeuvre P,Martin DP,Harkins G,Lemey P,Grace Aja,Meredith M,Lakay F,Monjane A,Lett J-M,Varsani A,Heydarnejad H.番茄黄叶卷曲病毒从中东传播到世界。PLOS PARCOG。2010; 6:E1001164。

    文章谷歌学术

  3. 3.

    Anfoka G.番茄黄叶卷曲病毒的基因沉默。正确答案:Czosnek H,编辑。番茄黄曲叶病毒病。多德雷赫特:施普林格;2007. p。391-405。

    谷歌学术

  4. 4.

    Brunetti A,Tavazza M,Noris E,Tavazza R,Caciagli P,Ancora G,Craespi S,Accotto G.高表达截短的病毒Rep蛋白在转基因番茄植物中对番茄黄叶卷曲病毒的抗性。Mol植物微生物相互作用。1997年; 10:571-9。

    CAS文章谷歌学术

  5. 5.

    UEDA S,Kimura T,Onuki M,Hanada K,Iwanami T.三个不同的孤立群体番茄黄卷叶病毒在日本和传染性克隆的建设。J Gen Plant Pathol。2004; 70:232-8。

    文章谷歌学术

  6. 6.

    关键词:番茄,遗传,模型系统,遗传模型植物j . 1997; 12:1465 - 72。

    CAS文章谷歌学术

  7. 7。

    Takahashi H,Shimizu A,Arie T,Rosmalawati S,Fukushima S,Kikuchi M,Hikichi Y,Kanda A,Takahashi A,Kiba A,Ohnishi K,Ichinose Y,Taguchi F,Yasuda C,Kodama M,Egusa M,Masuta C,Sawada H,Shibata D,Hori K,Watanabe Y.微米番茄醇对常见真菌,细菌和病毒病原体的反应目录。J Gen Plant Pathol。2005; 71:8-22。

    文章谷歌学术

  8. 8。

    针对TYLCV外壳蛋白转录本的siRNA的产生导致了其表达的沉默和对病毒的抗性。转基因研究》2007;16:385 - 98。

    CAS文章谷歌学术

  9. 9。

    艾曼纽E,利维AA。番茄突变体作为功能基因组学的工具。植物生物学。2002;5:12 - 7。

    CAS文章谷歌学术

  10. 10.

    Czosnek H,Ber R,Navot N,Zamir D.用病毒DNA探针杂交杂交检测植物和昆虫裂解物中的番茄黄叶卷曲病毒。植物DIS。1988; 72:949-51。

    文章谷歌学术

  11. 11.

    Ber R,Navot N,Zamir D,Antignus Y,Cohen S,Czosnek H.番茄的感染番茄黄叶卷曲病毒:对病毒DNA的感染,症状发展和积累的易感性。拱病毒。1990年; 112:169-80。

    CAS文章谷歌学术

  12. 12.

    Abhary M, Patil BL, Fauquet CM。番茄黄卷叶状病毒的分子多样性、分类学和命名。正确答案:Czosnek H,编辑。番茄黄曲叶病毒病。多德雷赫特:施普林格;2007. p。85- - - - - -118。

    谷歌学术

  13. 13.

    Stenger DC,Revington GN,Stevenson MC,Bisaro DM。从Tandemly重复拷贝的Geminivirus基因组的透析释放:植物病毒DNA滚动圆圈复制的证据。PROC NAT ACAD SCI USA。1991; 88:8029-33。

    CAS文章谷歌学术

  14. 14.

    番茄黄卷叶病毒是一种由白蝇传播的番茄双生病毒。疾病媒介研究1994;10:259-88。

    文章谷歌学术

  15. 15.

    Czosnek H,Ber R,Antignus Y,Cohen S,Navot N,Zamir D.番茄黄叶卷曲病毒的分离,是Geminivirus。植物疗法。1988; 78:508-12。

    文章谷歌学术

  16. 16.

    Kheyr-Pour A, Gronenborn B, Croznek H. H. agro接种番茄黄卷叶病毒(TYLCV)克服了野生病毒的抗性Lycopersicon.物种。植物育种。1994年; 112:228-33。

    CAS文章谷歌学术

  17. 17。

    关键词:番茄,黄卷叶病毒,分离,体外接种性研究j . 2010; 7:84。

    文章谷歌学术

  18. 18。

    人工锌指蛋白抑制病毒DNA复制的血清t。J微生物学报。2005;79:2614-9。

    CAS文章谷歌学术

  19. 19。

    用人工锌指蛋白抑制番茄黄曲叶病毒Rep与其复制源的结合。生物科技摩尔》。2013;54:198 - 203。

    CAS文章谷歌学术

下载参考

确认

我们感谢Ryohey Arimoto(Takii&Co.,Ltd.,Shiga,Japan)为他的DNA样本的礼物从感染TylCV感染的西红柿中提取。我们感谢Drs。Tadayuki Imanaka和Haruyuki Atomi(京都大学,京都,日本)用于使用他们的DNA测序仪。

资金

这项工作得到了促进创新生物科学基础研究活动计划(PROBRAIN)对T.S.的资助

作者信息

隶属关系

作者

贡献

TM进行实验并撰写稿件。KT和FD进行了实验。YA对结果进行了讨论。TS设计了研究并撰写了论文。所有作者都阅读并批准了原稿。

通讯作者

对应于Takashi Sera.

道德声明

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

额外的信息

出版商的注意事项

188金宝搏牛牛技巧《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。

补充信息

额外的文件1

:数据描述:受感染的Micro-Tom中TYLCV基因组的质粒构建和检测。

权利和权限

开放获取本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料包括在文章的创作共用许可中,除非在材料的信用线中另有说明。如果材料没有包含在文章的创作共用许可证中,而您的预期使用不被法律法规允许或超过允许的使用,您将需要直接获得版权持有人的许可。如欲浏览本许可证的副本,请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.“创作共用公共领域”豁免书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据,除非在数据的信用额度中另有说明。

再版和权限

关于这篇文章

通过十字标记验证货币和真实性

引用这篇文章

森,T.,竹中,K.,本,F.。等等。通过子叶植物的农学分动,开发一种快速评估微米西红柿对番茄黄叶卷曲病毒的抗性/敏感性的方法。BMC RES笔记14,237(2021)。https://doi.org/10.1186/s13104-021-05651-3

下载引用

关键词

  • 农杆菌
  • Agroinoculation
  • Cotyledon.
  • Micro-Tom
  • 番茄黄卷叶病毒